כל מועד וחג נתייחדה לו דמות משלו בהלכה ובנוהג שבמקדש. ואם חג הפסח התייחד כחגה של המשפחה וחג הסוכות כיום המועד לשמחה בציבור, הרי עיקר ייחודו של יום זה במקדש הוא עבודת הכוהן הגדול המכוונת לשם כפרת עוונות העם. העבודה כולה, גם עבודות התמיד וגם עבודות היום, על חמשה עשר קרבנותיה, נעשתה רק בידי הכוהן הגדול. ובכל עבודות היום לא נטלו חלק שאר הכוהנים ומכל שכן שאר העם. רק עבודות העזר והעבודות אשר נעשו מחוץ למקדש כמו שריפת פרו של הכוהן הגדול ושליחת השעיר לעזאזל נעשו על ידי כוהנים אחרים או גם על ידי ישראליים.
העם התאסף ביום זה למקדש כדי לחזות בעבודה ובכוהן הגדול המשרת בקודש וליוה בחרדה את כניסתו וצאתו של הכוהן הגדול מקודש הקדשים. וגם מבבל ומצרים מצויים היו כוהנים וישראלים במקדש ביום הכפורים. עוד לפני קריאת הגבר היתה העזרה מלאה מישראל ובשרפת הפר היו צריכין להעמיד זקיפין "מפני דיחוק העם כדי שלא יהיו קופצין ונופלין לתוך המערכה" (תוספ. יומא פ"ד הי"ז).
בשאר המועדים במקדש נטל העם חלק במצוות היום, אולם ביום הכפורים לא השתתף העם במהלך העבודה אלא עקב אחריה בדומיה. רק בשמעו את השם יוצא מפורש מפי כוהן גדול נפל על פניו השתחוה וענה בברכה המקובלת במקדש: ברוך שם כבוד מלכותו לעולם ועד.
כבר בתאור מעשי היום בתורה אנו למדים כי חשיבות מיוחדת יוחסה לעבודת היום ביום הכפורים. ובמשנה, במסכת יומא, מוצאים ליד ההלכות הנוגעות לעניני היום גם תאור ספרותי רחב המעלה לעינינו את סדר העבודה ואת ההוי במקדש ביום זה.
תאור העבודה שבמשנה קרוב לראותו כאחת הנוסחאות מהמטבעות הספרותיות אשר נוצרו לתאורו של סדר העבודה. בימי האמוראים מצויים היו נוסחאות שונות של סדר העבודה, וכבימינו אנו, מקובל היה לקראם בתפילת יום הכפורים (יומא לו' ב' ועוד). בין הפפירוסים היהודיים הכתובים עברית אשר נתגלו במצרים מצויים כמה קטעים אשר הנם ללא ספק שרידים מסדר עבודה שהיה מקובל בין יהודי מצרים. שרידים אלה שייכים, לדעת המוציאים לאור, לסוף המאה השניה, תחילת המאה השלישית (הקטעים נתפרסמו על ידי ב-Cowly II J.A.A
שבעת ימים קודם יום הכפורים מפרישין את הכוהן הגדול מביתו, מחשש טומאה, ללשכה מיוחדת במקדש והוא מכין עצמו לקראת העבודה. זקני בית דין וזקני כהונה חוזרין לפניו על סדר עבודת היום והכוהן הגדול הרגיל את עצמו בעבודות השונות: "כל שבעת ימים הוא זורק את הדם ומקטיר את הקטורת ומטיב את הנרות" (יומא פרק א' וב'). בימי הבית השני לא תמיד נזקקו הכוהנים הגדולים לעבודת הקרבנות במקדש, ולא תמיד רצויה היתה עבודתו בקודש שהרי העבודה מחולקת היתה בין המשמרות.
בערב יום הכפורים השביעו את הכוהן הגדול שלא יתקן את הקטורת מחוץ לקודש הקדשים כדעתם של הצדוקים אלא בפנים כדעת הפרושים: "משביעין אנו עליך במי ששכן שמו בבית הזה שלא תשנה דבר מכל מה שאמרנו לך" (יומא פ"א מ"ה). למעשה זה היו צריכין להשביע את הכוהן הגדול, מה שאין כן לשאר העבודות במקדש. שאר העבודות נעשו לעיני העם בעוד שבהקטרת הקטורת כל העם פרש מההיכל. בעבודות האחרות נצב היה על גבי הכוהן הגדול הסגן, שבא מחוגי הפרושים, ועמד והשגיח עליו לבל יסטה מן ההלכה והנוהג של הפרושים, כמו שמצינו בניסוך המים בחג הסוכות, ואף בעבודת יום הכפורים עצמה בהטלת הגורלות שנעשתה לעיני הציבור לא נזקקו להשביע את הכוהן לבל יסטה מן ההלכה כפי שהורו הפרושים.
הכהונה הגדולה נשארה בידיהם של הצדוקים והביתוסים עד ימיו האחרונים של הבית, אולם עלה בידי הפרושים להטביע את חותמם על סדרי העבודה וחיי המקדש. וקרוב לוודאי כי משרת הסגן במקדש נוצרה לשם הפיקוח על הכוהן הגדול. שנים משלושת הסגנים הידועים לנו בשמם מן הספרות התלמודית או יוסיפוס, כרבי חנינא סגן הכוהנים ורבי אלעזר בן חנניה (אולי גם אביו של רבי שמעון בן הסגן), מחכמי הפרושים היו. ואף ראש בית האב שעמד לשמאלו של הכוהן הגדול מחוגי הפרושים היה ונתן דעתו "שלא תתנו מקום לצדוקים לרדות אחריכם" (משנת יומא פ"ד מ"א ובבלי שם מ' ע"א והשוה תוספתא פ"ג ה"א). הכוהנים הגדולים הצדוקים נאלצו לכפוף עצמם להוראתם של חכמי ישראל. וצדוקי אחד אומר לבנו הכוהן הגדול: אף על פי שאנו דורשין אין אנו עושין, שומעין אנו לדבר חכמים (תוספתא יומא פ"א ה"ח). "שלוחי בית דין ואתה שלוחנו" (יומא פ"א מ"ה).
בליל יום הכפורים נשאר הכוהן הגדול ער כל הלילה מחשש טומאת קרי. פרחי כהונה ובני יקירי ירושלים היו שוקדין להעסיקו כדי שלא יתנמנם. קוראים לפניו בכתבי הקודש וכשבקש להתנמנם מכין לפניו באצבע צרדה:
"אם היה חכם דורש ואם לאו תלמידי חכמים דורשין לפניו ואם רגיל לקראות קורא ואם לאו קורין לפניו ובמה קורין לפניו? באיוב בעזרא ובדברי הימים. זכריה בן קבוטל אמר: פעמים הרבה קריתי לפניו בדניאל. בקש להתנמנם פרחי כהונה מכים לפני באצבע צרדה ואומרים לו אישי כוהן גדול עמוד והפג אחת על הרצפה ומעסיקין אותו עד שיגיע זמן השחיטה" (יומא פ"א מ"ו).
הברייתא מוסיפה:
מיקירי ירושלים לא היו ישינין כל הלילה כדי שישמע כהן גדול קול הברה ולא תהא שינה חוטפתו (יומא י"ט ב'). ובהמשכה של הברייתא אנו קורין: תני אבא שאול אמר אף בגבולין היו עושין כן זכר למקדש.
בחצות החל הכוהן הגדול בעבודה, בהרמת הדשן, כדי שיספיק את כל העבודה. לאחר הקמת הדשן פרסו סדין של בוץ בינו לבין העם. פשט ירד וטבל עלה ונסתפג ולבש את בגדי הזהב. בין עבודה לעבודה, בין עבודה שנעשתה בפנים ההיכל ובין עבודה שנעשתה בחוץ, היה הכוהן הגדול טובל ובגמר העבודה ובראשיתה היה מקדש ידיו ורגליו. חמש טבילות ועשרה קדושין טובל כוהן גדול ומקדש בו ביום. (יומא פ"ג מ"ג). עבודת התמיד עשאן הכוהן הגדול בבגדי הזהב אשר לו, אולם את עבודות היום הנעשות בעיקר בפנים ההיכל עשאן בבגדי לבן.
לאחר עבודת התמיד החל הכוהן הגדול בעבודה מיוחדת ליום הכפורים: סמך ידו על פרו והתודה על עונותיו ועל עונות ביתו וכך היה אומר: אנא השם עויתי פשעתי חטאתי לפניך אני וביתי אנא השם כפר נא לעונות ולפשעים ולחטאים שעויתי אני וביתי (פ"ג מ"ח). והבריתא בירושלמי מוסיפה: הקרובים היו נופלין על פניהן הרחוקים היו אומרים ברוך שם כבוד מלכותו לעולם ועד. אלו ואלו לא היו זזים משם עד שהוא (שם המפורש) מתעלם מהם (פ"ג מ"ג-מ"ד). וכך אנו קוראים בכל סדרי העבודה אף בקדומים שבהם המיוחסים לר' אליעזר הקליר ויוסי היתום: והכוהנים והעם העומדים בעזרה כשהיו שומעים את השם הנכבד והנורא מפורש יוצא מפי כהן גדול בקדושה ובטהרה היו כורעים ומשתחוים ונופלים על פניהם ואומרים ברוך שם וכו'. במשנת תמיד נמנה קולו של הכוהן הגדול, בהשמיעו את השם המפורש ביום הכפורים, בין הקולות שהיו נשמעין עד יריחו (פ"ג מ"ח).
לאחר הוידוי טרף בקלפי והעלה שני גורלות על שני השעירים אחד כתוב עליו: לעזאזל ואחד כתוב עליו: לשם. בשעת העלאת הגורלות עמד הסגן מימינו וראש בית אב משמאלו ולסימן ברכה נחשב הדבר אם של שם עלה בימין והבריתא מספרת: ארבעים שנה ששמש שמעון הצדיק היה גורל עולה בימין (יומא מ"א ע"ב). ובריתא אחרת שונה: ארבעים שנה קודם חורבן הבית לא היה גורל עולה בימין (שם מב). הצדוקים הרשו לעצמם להחליף את הגורלות אם של שם עלה בשמאל והסגן וראש בית אב היו מקפידין עליו שלא ישנה. אם של שם עלה בימינו הסגן אומר לו: אישי כהן גדול הגבה ימינך ואם של שמאל עלה בימינו ראש בית אב אומר לו: הגבה שמאלך (יומא פ"ד מ"א). קשר לשון של זהורית בראש שעיר המשתלח והעמידו כנגד בית שלוחו ובא לו שנית לפרו להתודות סמוך לשחיטתו. בודוי זה כלל גם את אחיו הכוהנים: ושחטאתי לפניך אני וביתי ובני אהרון (יומא פ"ד מ"ב). ובריתא מדבי רבי ישמעאל מסבירה: כך היא מידת הדין נותנת מוטב יבא זכאי ויכפר על החייב ואל יבא חייב ויכפר על החייב (יומא מ"ג ע"ב והשוה ירושלמי).
לאחר שחיטת הפר פנה הכוהן הגדול להקטיר את הקטורת בקודש הקדשים. מערכת מיוחדת של עצים הוכנה לשם זה ובכלים מיוחדים של זהב אדום היתה נעשית. גם הקטורת עצמה הוכנה במיוחד לשם כך. ערב יום הכפורים הכניסו מחדש את הקטורת למכתש וכתשוה פעם נוספת כדי תעשה דקה מן הדקה. כמות הקטורת אשר הוקטרה כפולה היתה מזו שבכל יום. הכוהן הגדול גם הכין עצמו במיוחד לכך, קדש ידיו ורגליו לא מן הכיור אלא מקתון של זהב שמיוחדת היתה לכך. הבגדים שבהם נכנס לקודש הקדשים לא לבשם אלא הניחם שיבלו במקומם (ירוש. יומא פ"ז מ"ד ע"ב). וכך שונה המשנה את סדר ההקטרה: נטל את המחתה בימינו ואת הכף בשמאלו היה מהלך בהיכל עד שמגיע לבין שתי הפרוכות בין הקדש ובין קדש הקדשים... החיצונה היתה פרופה מן הדרום, והפנימית מן הצפון. מהלך ביניהן עד שמגיע לצפון. הגיע לצפון הופך פניו לדרום, מהלך לשמאלו עם הפרוכת, עד שהוא מגיע לארון. הגיע נותן את המחתה בין שני הבדים. צבר את הקטורת על גבי גחלין ונתמלא הבית כולו עשן יצא ובא לו בדרך בית כניסתו ומתפלל תפילה קצרה בבית החיצון ולא היה מאריך בתפילתו כדי שלא להבעית את העם (יומא פ"ה מ"א). בשני התלמודים נשתמרו נוסחאות שונות ומתחלפות על תפילתו זו של הכוהן הגדול. אנו נעתיק את הנוסח שבתלמוד הבבלי הנראה להיות מהימן, ברם עיקרה של התפילה מצוי גם בתלמוד הירושלמי. וזה נוסחה:
יהי רצון מלפניך ה' אלוהינו שתהא שנה זו שחונה וגשומה לא יעדי עביד שולטן מדבית יהודה ולא יהיו עמך בית ישראל צריכין לפרנסה זה מזה ולא תכנס לפניך תפילת עוברי דרכים (יומא נ,ג ע"ב).
בירושלמי מצויה עוד פיסקא:
ועל אנשי השרון היה אומר: יהי רצון מלפניך ה' אלהינו ואלהי אבותינו שלא יעשו בתיהן קבריהן. על בתיהם הרעועים של אנשי השרון אנו למדים גם ממקום אחר במשנה (סוטה פ"ח מ"ג).
בשני התלמודים אנו קוראים: מעשה בכהן גדול אחד שהאריך בתפילתו ונמנו אחיו הכהנים ליכנס אחריו. התחילו הם נכנסין והוא יוצא, אמרו לו: מפני מה הארכת בתפילתך? אמר להם: קשה בעיניכם שהתפללתי עליכם ועל בית המקדש שלא יחרב. אמרו לו: אל תהי רגיל לעשות כן (יומא שם). כניסתו ויציאתו של הכהן הגדול לוותה בחרדה רבה שמא יארע פגע לכוהן הגדול בהיותו בקודש ויכשל בעבודתו. בעסק גדול היה כל העם מלווה את הכהן הגדול לאחר גמר עבודתו לביתו "ויום טוב היה עושה לכל אוהביו שיצא בשלום" (תוספתא יומא פ"ד ה"כ).
החיבה וההערצה לכהן הגדול שנכנס לפני ולפנים להקטיר קטורת לפני ה' לא היה בהם כדי לחפות על מעשיהם של כהנים גדולים שלא הלכו בדרכו של אביהם זקנם אהרן והעם היה מעדיף בגלוי את מוריו, חכמי ישראל, על אף מוצאם הדל. ברייתא אחת השנויה בתלמוד הבבלי מעלה מציאות זו על ההתנגשות שבין הכוהנים הגדולים שנטשו מסורת אבות לבין החכמים המטפחים את מורשת המסורת. לפיסקא זו של המשנה המסורת על יום הטוב שהיה הכוהן הגדול עושה לאוהביו שונה הברייתא: "תנו רבנן מעשה בכוהן גדול אחד שיצא מבית המקדש והוו אזלי כולי עלמא בתריה כיון דחזיונהו לשמעיה ואבטליון, שבקוה לדידיה וזלי בתר שמעיה ואבטליון לאיפטורי מיני דכהן גדול, אמר להן: ייתון בני עממין לשלם. אמרון ליה ייתון בני עממין לשלם דעבדין עובדא דאהרן ולא ייתי בר אהרן לשלם דלא עבדי עובדא דאהרן" (יומא ע"א ע"ב).
לאחר הקטרת הקטורת בקדש הקדשים הזה את הדם על הפרוכת ויצא לעזרה והתודה על ראש השעיר המשתלח את חטאות העם. אחר הודוי נמסר השעיר למשלח כדי לשלחו לעזאזל. המשנה מוסרת כי עשו כבש של עץ אשר חבר את הר הבית עם הר המשחה ועליו היה המשלח מעביר את השעיר בכדי שלא יצטרך לעבור בין העם שהיו דוחקים בו כדי שימהר ביציאתו ורואים מצוה לפגוע ולחבל בשעיר. במשנה אנו קוראים: וכבש עשו לו מפני הבבליים שהיו מתלשים בשערו ואמרים לו: טול וצא (משנה יומא פ"ו מ"ד). הברייתא בבלי מוסיפה: תנא מה שהי צפירא דין וחובי דרא סגיאין (בבלי שם סו ע"ב). בתוספתא ובשני התלמודים נאמר כי אלה הם מאיצים במשלח והפוגעים בשעיר לא היו בבליים אלא אלכסנדרוניים ואמנם מוצאים אנו דברים אלו באגרת בר נבא, חבור אלכסדרוני נוצרי קדום. בעל האגרת מספר גם על הפגיעות אשר פוגעים ומחבלים בשעיר המשתלח.
המשנה מספרת לנו ברוב ענין את סדר הליכתו של המשלח עד שמגיע למדבר יהודה במקום שמשלח את השעיר לעזאזל. עשר סוכות הוכנו בדרך ובכל סוכה ישבו מספר אנשים ובידם מזון ומים שמא לא יוכל המשלח לעמוד בצמא ויזקק להם בדרך. מיקירי ירושלים היו מלוים אותו עד לסוכה הראשונה ומשם אנשי כל סוכה הלכו עמו עד לסוכה הבאה. אנשי הסוכה האחרונה לא היו מתלוים אליו ורק מרחוק עמדו וראו במעשהו. הגיע למקום שלוחו דחף לשעירו מאחוריו והוא מתגלגל ויורד מצוק הסלע. על ידי הנפת סודרין היו מודיעין לירושלים כי הגיע השעיר למדבר וכי נזרק מצוקי הסלעים (יומא פרק ו').
לאחר שהודיעו לכהן הגדול כי הגיע השעיר למדבר בא הכהן הגדול לחלק האחרון של עבודת היום לקריאת התורה. אין המשנה מוסרת היכן התקימה קריאת התורה. לדעת האמוראים קרא בעזרת הנשים במקום המרוח בשטח המקדש (יומא פ"ט ע"ב). הקריאה היתה בפרשת היום בפרשת אחרי-מות, "וגולל את התורה ומניחה בחיקו ואומר: יותר ממה שקריתי לפניכם כתוב כאן" (פרק ז' משנה א'). ומסיים בשמונה ברכות.
באותה שעה שהכהן קרא בתורה שרפו מחוץ לעזרה את פר החטאת של הכהן הגדול ואלה אשר הלכו לראות את שריפת הפר לא יכלו להאזין לקריאת התורה: "הרואה כהן גדול שהוא קורא אינו רואה פר ושעיר הנשרפים לא מפני שאינו רשאי אלא שהיתה דרך רחוקה ומלאכת שניהם היתה נעשית כאחת" (שם פ"ז מ"ב). מכל קרבנות היום שעיר החטאת הנו הקרבן היחידי אשר נאכל לכוהנים והמשנה במנחות מוסרת: "חל להיות ערב שבת שעיר של יום הכפורים האכל לערב הבבליין אוכלין אותו כשהוא חי (כי אין שהות לבשלו) מפני שדעתן יפה" (פי"א מ"ח).
הכוהנים בני התפוצות שלא היו מצוים תדיר במקדש להוטים היו ביותר אחר אכילת הקרבנות ומוכנים היו לאכול את בשר הקרבן כשהוא חי, שכן אי אפשר היו לבשלו בשבת ואף אין להשאירו עד לאחר השבת שלא יבוא לידי פסול.
עם חורבן הבית העלו על הכתב פרקים מן ההווי במקדש. פרקים רבים מן תאורים אלו שקע רבי יהודה הנשיא במשנתנו בפרק ג' של משנת ביכורים המעלה את סדר הבאת הביכורים. פרקים ד' וה' של משנת סוכה הסודרים את מעשה החג במקדש וכיוצא באלו רבים אחרים. סדר העבודה של יום הכפורים זכה לחיבה יתרה מחמת הנוהג להעלות את סדר העבודה בתפילה ומשום כך כבר מימים ראשונים רבו היצירות הספרותיות המעלות את סדר קדושת היום. אף לאחר חתימת המשנה והתפשטותה בכל בית ישראל, מצויים בידינו עד ימינו אלו סדרי עבודה שאינם תואמים את תאור סדר העבודה שבמשנה בכל פרטיו. מיוסדים הם על מסורות השונות בכמה פרטים ממסורות הלכה שבמשנתנו. המסורות על תאורי סדר העבודה היו כה רווחת בעם עד אשר משנתנו, אשר ההלכה שבה התרווחה בכל העם, לא היה בכוחה לעקור את מסורת סדרי העבודה. ברם מסורות חלוקות אלו שונות רק בפרטים מסוימים, כללו של סדר העבודה מאושש בכל המסורות כולן ומכולן עולה הצפיה לסליחת העונות לטהרה ולקדושה.